Easy Editing Cas9 Pro Kit

1. 产品简介：

Easy Editing Cas9 Pro Kit是基于本公司的自递送基因编辑试剂盒，在Cas9酶和自递送转染试剂的基础上，组合了靶向T细胞受体α亚基TRAC基因的sgRNA，并且组合了AAV病毒作为供体，可以在TRAC基因切割位点插入靶向CD19的CAR基因。

其中sgRNA的序列为：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA。本试剂盒中采用的sgRNA序列经过特殊修饰，能显著提高细胞内稳定性，提高编辑效率。

AAV病毒包含的Donor序列及插入位点信息如下：

本试剂盒操作简便，不需要昂贵的电转系统，CAR的插入效率可高达70%以上且无细胞毒性。是用于T细胞基因编辑、建立CAR-T细胞制备体系的理想的标准试剂盒。

2. 产品组份和运输储存条件：

运输和储存条件：本品需干冰运输。到货后放置在-20℃冰箱3个月内用完，长期不使用须保存于-80℃冰箱。

3. 实验步骤：

3.1 培养T细胞，建议先激活48小时，之后取1E6的细胞数，300g 离心5分钟，加新鲜培养基，接种到6孔板的1个孔，培养过夜。

3.2 实验当天，将试剂盒从冰箱中取出，放置在室温；

3.3 配制转染复合物：将1.5uL Solution III （sgRNA 100uM）和1.5uL Solution I（Cas9酶）在1.5ml EP管中混合后放置在37℃培养箱孵育5-10分钟，形成RNP；随后加入2uL AAV病毒，加入50uL Solution II（自递送转染试剂）（使用前吹打混匀），与RNP充分吹打混匀后，在室温下继续孵育5分钟，形成转导复合物；

3.4 孵育等待期间，将T细胞吹打混匀，全部转移到离心管中，300g离心5分钟，弃除干净培养基上清；

3.5 用PBS重悬细胞，再次300g离心5分钟；

3.6 弃干净上清，用3.3制备的转导复合物重悬细胞沉淀，轻轻混匀后，转移至37℃培养箱孵育45分钟；

3.7 向孵育后的细胞混合液中加入600uL含10% FBS和200U IL2 的T细胞培养基，将细胞重悬后铺到24孔板中进行培养，保持细胞密度在2-3E6/ml；

3.8 培养4-5天后，对细胞进行编辑效率检测；

4. 结果示例：对人体原代T细胞，敲除内源性TRAC，并敲入人工CAR序列，构建CAR-T细胞

图：采用本试剂盒，培养到第7天时CAR-T阳性率达到71.9%。

5. 其他相关产品

6. 引用文献

(1) Ran, F., Hsu, P., Wright, J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281–2308 (2013).

(2) Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83.

(3) Ren J, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, Zhao Y. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistant to PD1 Inhibition. Clin Cancer Res. 2017 May 1;23(9):2255-2266. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1300. Epub 2016 Nov 4. PMID: 27815355; PMCID: PMC5413401.

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