Easy Editing Cas12a Kit

1. 产品简介：

Easy Editing Cas12a Kit是一款自递送 CRISPR/Cas12a基因编辑工具，操作简便，不需要昂贵的电转系统，编辑效率高达 85-90%且无细胞毒性。是除Cas9酶之外用于KO/KI基因编辑的理想试剂盒。本产品适用于各种原代细胞和细胞系的基因编辑。

2. 产品组份和运输储存条件：

运输和储存条件：本品需干冰运输。到货后放置在-20℃冰箱3个月内用完，长期不使用须保存于-80℃冰箱。

3. 使用方法：

3.1 实验前1-2天，将细胞以合适的密度接种，使细胞24-48小时后达到80%融合度（以T细胞为例，建议激活48小时后，取1E6的细胞数，300g 离心5分钟后，加培养基铺到新板，第二天编辑）。

3.2 实验当天，将试剂盒从冰箱中取出，放置在室温；

3.3 配制转染复合物：将1.5uL crRNA（100uM）和1.5uL Solution I在1.5ml EP管中混合后放置在37℃培养箱孵育5-10分钟，形成RNP；随后加入50uL Solution II（使用前吹打混匀），与RNP充分混匀后，在室温下继续孵育5分钟，形成转导复合物；

3.4 孵育等待期间，如果处理贴壁细胞，将细胞消化并中和胰酶后吹打成单细胞，如果处理悬浮细胞，直接吹打混匀；

3.5 细胞计数，取1E6细胞数量对应的细胞悬液，将细胞离心后，务必彻底弃除干净培养基；

3.6 用PBS重悬细胞，再次300g离心5分钟；

3.7 弃干净上清，用3.3制备的转导复合物重悬细胞沉淀，轻轻混匀后，转移至37℃培养箱孵育45分钟；

3.8 向孵育后的细胞混合液中加入适量培养基后转入孔中继续培养，例如加入2mL培养基后转移入6孔板的一个孔进行培养（对于1E6的T细胞，加入600uL含10% FBS和200U IL2 的T细胞培养基，将细胞重悬后铺到24孔板中进行培养，保持细胞密度在2-3E6/ml）；

3.9 培养4-5天后，对细胞进行编辑效率检测；

注意：

v 如果要在切割位点进行基因敲入，需配合AAV (MOI: 2E4-5E4)病毒，若加入AAV体积小于5ul，将AAV加到3.3制备的转导复合物中。如果AAV滴度低，加入体积过大，将 AAV 加入到3.8的培养基中。

v 如需多基因编辑，在步骤3.3进行多RNP分别的制备。

v 编辑前细胞状态对编辑效率有显著影响，应使培养细胞处在良好状态。

4. 应用案例：对人体原代T细胞，敲除内源性TRAC，并敲入人工CAR序列，构建CAR-T细胞

图：采用本试剂盒，配合AAV病毒Donor，培养到第7天时CAR-T阳性率达到91.3%。

5. 其他相关产品

6. 引用文献

(1) Ran, F., Hsu, P., Wright, J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281–2308 (2013).

(2) Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83.

(3) Ren J, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, Zhao Y. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistant to PD1 Inhibition. Clin Cancer Res. 2017 May 1;23(9):2255-2266. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1300. Epub 2016 Nov 4. PMID: 27815355; PMCID: PMC5413401.

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